В последние годы в процессе разработки лекарственных препаратов на основе белковых молекул значительно возросли требования к производительности, и усилия многих компаний направлены на способы автоматизации исследований.
При разработке рекомбинантных белков плазмидную ДНК необходимо постоянно восстанавливать из исходных запасов, чтобы использовать их для трансфекции. Для тех, кто хочет автоматизировать процесс производства плазмид статья, написанная Карен Билечи и коллегами из Genentech, будет очень информативной [J Lab Autom. 2016 Dec;21(6):765-778.doi: 10.1177/2211068216630547. Epub 2016 Feb]. Авторы описывают, как автоматизированный процесс MiniPrep был настроен в их лаборатории, которая очищала 24 000 образцов плазмид в месяц. Цель состояла в том, чтобы получить высокопроизводительный автоматизированный процесс, который генерирует очищенную плазмидную ДНК такого же или более высокого качества, чем использованный ранее полуавтоматический метод. Описывается не только окончательный процесс, но и экспериментальная работа, которая была проведена для настройки этого метода и обеспечения качества конечных образцов.
Трансформация
Во-первых, автоматическую трансформацию проводили в системе обработки жидкости Hamilton Microlab STAR, которая смешивала плазмидную ДНК и компетентные клетки. После инкубации на системе Hudson RapidPick Complete выполняли автоматический сбор колоний, колонии инокулировали в планшеты с глубокими лунками и снова инкубировали.
Установка для очистки плазмид
Для подготовки образцов и очистки плазмид была разработана индивидуальная система из трех платформ Oasis (LM900) с 29 позициями SBS, каждая из которых интегрирована с роботизированной рукой на направляющей для перемещения образцов между подключенными платформами и удаления использованных расходных материалов. Одна система использовалась для подготовки образцов, а две другие – для очистки образцов – последняя оснащена вакуумными станциями для сушки наконечников и позициями для штабелированных пластин. Два насоса, расположенные под платформами, наполняли палубные резервуары буферами. Кроме того, на одном конце интегрированная система была оборудована гостиницей для тарелок и подставкой для наконечников. Эта автоматизированная система очистки плазмид позволяет очищать до 16 96-луночных планшетов за цикл.
Автоматическую очистку плазмидной ДНК проводили с использованием колонок MiniPrep PhyTip®. Эти колонки заменили предыдущий формат с использованием с использованием 96-луночных кремнеземных мембран в полуавтоматическом методе вакуумной хроматографии. Проблема с предыдущим решением заключалась в том, что вариации условий культивирования клеток и осадка образцов затрудняли перенос супернатанта с плазмидной ДНК из обрабатывающей лунки на мембрану. Это потребовало ручного контроля образцов.
Колонки MiniPrep PhyTip были выбраны для очистки плазмид по следующим причинам:
1. с помощью этого метода можно получить плазмидную ДНК необходимой степени секвенирования и трансфекции.
2. этот метод совместим со стандартным оборудованием для работы с жидкостями для автоматизации лаборатории.
3. этот метод полностью автоматический не требует ручного сопровождения
4. этот метод масштабируется до необходимой производительности.
Процесс очистки плазмидной ДНК с колонками MiniPrep PhyTip®
Центрифугированные клетки ресуспендируют, лизируют и осаждают в 96-луночном планшете, а захват плазмиды на колонках MiniPrep PhyTip проводят непосредственно из тех же лунок с помощью противоточно (двойной проточной) хроматографии.
Качество очищенной плазмидной ДНК
Как упоминалось выше, плазмидная ДНК из нового автоматизированного метода должна была иметь такой же выход и чистоту, что и ранее использовавшийся полуавтоматический метод. Колонки MiniPrep PhyTip объемом 1 мл с объемом смолы 80 мкл были выбраны после сравнения с полуавтоматическим методом и колонками MiniPrep PhyTip с объемом наконечника 200 мкл. Результаты свидетельствуют о лучшей динамике жидкости в большей колонке PhyTip с более высоким выходом и чистотой в результате. Выход плазмиды при автоматической очистке плазмиды на колонках MiniPrep PhyTip объемом 1 мл составлял около 10 мкг и отношения A260 нм / A280 нм> 1,8. Эти результаты были очень похожи на полуавтоматический метод. Когда тысячи образцов клеток будут очищаться каждый месяц, в образцах обязательно будут различия. Проверка надежности автоматизированного метода позволяет предвидеть потенциальные проблемы, которые могут появиться в результате этого. Поэтому надежность метода очистки плазмиды оценивалась путем тестирования крайних случаев, например, плотности клеточной культуры. Плазмиды очищали от идеальных, компактных и разросшихся культур клеток. Выход плазмиды был таким же или немного выше для автоматизированного метода по сравнению с полуавтоматическим методом для идеальных и компактных культур клеток. Для разросшихся культур клеток выход при автоматизированном методе был значительно ниже.
Переходная эффективность трансфекции
Поскольку очищенная плазмидная ДНК должна была использоваться для временной трансфекции для экспрессии рекомбинантных белков, оценивали эффективность временной трансфекции. Эффективность временной трансфекции тестировали с использованием плазмиды, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), с прямым и обратным подходом с тремя различными наборами для трансфекции. Клетки COS7 трансфицировали плазмидой. Эффективность трансфекции образца плазмиды определялась путем визуализации трансфицированных клеток и подсчета количества клеток, которые стали зелеными в результате поглощения гена GFP. В целом эффективность трансфекции при ручном и автоматическом методах была сопоставима.
Эффективность трансфекции определяется количеством клеток COS7, трансфицированных тремя различными наборами для трансфекции, и плазмидной ДНК, очищенной с помощью автоматизированного метода MiniPrep.
Дополнительную информацию и данные о колонках MiniPrep PhyTip® можно запросить у наших менеджеров